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流動相的pH和緩沖液離子濃度對分離和色譜保留的影響

點擊:   作者:天友利標準光源有限公司      發布日期:2014-07-08
用反相色譜分離酸性或堿性組分要求流動相為酸性或堿性,或者加入緩沖液。酸、堿和緩沖液的概念是一致的,但在HPLC的流動相中加酸、加堿的作用和加緩沖液的作用有些不同。 反相色譜的固定相是以烷烴鏈為主的非極性鍵合相,加十八烷基硅烷(C18),對非極性組分保留時間
  用反相色譜分離酸性或堿性組分要求流動相為酸性或堿性,或者加入緩沖液。酸、堿和緩沖液的概念是一致的,但在HPLC的流動相中加酸、加堿的作用和加緩沖液的作用有些不同。
  反相色譜的固定相是以烷烴鏈為主的非極性鍵合相,加十八烷基硅烷(C18),對非極性組分保留時間長,對極性組分保留時間短。
  流動相的pH<7時,酸性分為游離型(RCOOH),極性小,堿性組分為離子型(RNH3.C1),極性大。酸性組分在色譜柱上保留時間長,能充分在固定相和流動相之間多次分配,使用權得組分彼此間得以分離,增加組分的選擇性。
  若流相的pH>7時,堿性組分為游離型(RNH2),極性小,酸性組分為離子型(RCOO-Na),極性大。有利于堿性組分的分離。
  所以在分離酸性組分時流動相的pH<7,在分離堿性組分流動相的pH≥7。
  分析帶有竣基(—COOH)的次甘草酸,用的是典型的反相HPLC,隨著流動相的pH值減小,保留不斷加大。
  單純用酸或堿調節流動相的pH值是比較極端的情況,除非混合樣品中的組分是清一色的酸性組分或是清一色的堿性組分,一般不單加酸或單加堿。通常要分離的組分性質是多種多樣的,必須采用緩和的、經得直沖擊的緩沖液流動相。
  HPLC常用的緩沖液是由下列三類緩沖物質對配制的:乙酸、乙酸鈉(pH=3~6);磷酸-磷酸鹽(K+,Na+)pH=2~8);三羥甲基氨甲烷(Tris)-GC1(pH=7~9)。
  磷酸-磷酸鹽系列是硬酸鹽,與有機溶劑(甲醇、乙腈)混合時容易析了出不易看到的細微晶體。過濾掉,流動相的組成改變。不過濾,晶體傷泵、傷進樣器、傷柱、傷檢測器。如能滿足實驗條件,先選用軟酸鹽(乙酸鹽、Tris系列)。
  用緩沖液千萬不要忘記沖洗干凈。
  一些離子型的組分在無緩沖液的流動相中會離解生成H+或OH-,組分在柱內形成譜帶的那一部分引起流動相pH的變化,對色譜的分離產生影響。流動相內加了緩沖液使pH值的在一個范圍內還會變化,而且應變力是強大的,小小的組分離解引pH值的變化,而且應變力是強大的,小小的組分離解引起pH值的變化不足以改變整個流動的pH值。
  例如分析一組酸性組分的樣品:萘磺酸、腎上腺素、苯甲醇、去甲變腎上腺素。這些組分有的酸性強,有的酸性弱,有的呈兩性。還是采用C18柱,磷酸鹽沖液-甲醇為流動相,如果緩沖物質對的濃度過低,4個組分間的分離差,色譜峰嚴懲揚長拖尾。提高緩沖液的沖物質對濃度上述缺點得到克服。
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