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分光光度計的結構與使用方法

點擊:   作者:天友利標準光源有限公司      發布日期:2014-07-08
1.分光光度法定義與應用 1.1定義:分光光度法是利用物質所特有的吸收光譜來鑒別物質或測定其含量的分析檢測技術. 1.2特點:靈敏,精確,快速和簡便,在復雜組分系統中,不需要分離,即能檢測出其中所含的極少量物質. 1.3應用:生物化學研究中廣泛使用的方法之一,廣泛用于糖,蛋白

1. 分光光度法定義與應用
1.1 定義: 分光光度法是利用物質所特有的吸收光譜來鑒別物質或測定其含量的分析檢測技術.
1.2 特點: 靈敏,精確,快速和簡便,在復雜組分系統中,不需要分離,即能檢測出其中所含的極少量物質.
1.3 應用: 生物<>化學研究中廣泛使用的方法之一,廣泛用于糖,蛋白質,核酸,酶等的快速定量檢測. 
2. 的分類
2.2 分光光度計工作原理
2.3 分光光度計的基本結構
2.4 分光光度法的測量誤差
2.5 顯色反應及其影響因素
2.1 分光光度計的分類 分光光度計的分類
: 測定波長范圍為大于760 nm的紅外光區
可見光分光光度計: 測定波長范圍為400~760 nm的可見光區
紫外分光光度計: 測定波長范圍為200~400 nm的紫外光區
2.2 分光光度計工作原理
人眼可見的光只占電磁波譜的很小—部分(400~760nm)
它是一種頻率較大的電磁波.電磁波按頻率大小,從頻率最小的無線電波到頻率比較大的γ-射線排成一列,即組成電磁波的波譜,
2.2.1 分光光度計的光譜范圍
包括波長范圍為400~760 nm的可見光區和波長范圍為200~400 nm的紫外光區.不同的光源都有其特有的發射光譜,因此可采用不同的發光體作為儀器的光源.
鎢燈的發射光譜:鎢燈光源所發出的400~760nm波長的光譜,光通過三棱鏡折射后,可得到由紅,橙,黃,綠,藍,靛,紫組成的連續色譜;該色譜可作為可見光分光光度計的光源.
氫燈的發射光譜:氫燈能發出185~400 nm波長的光譜,可作為紫外光光度計的光源.
2.2.2 物質的吸收光譜(1) 
如果在光源和棱鏡之間放上某種物質的溶液,此時在屏上所顯示的光譜已不再是光源的光譜,它出現了幾條暗線,即光源發射光譜中某些波長的光因溶液吸收而消失,這種被溶液吸收后的光譜稱為該溶液的吸收光譜.
不同物質的吸收光譜是不同的.因此根據吸收光譜,可以鑒別溶液中所含的物質. 
2.2.2 物質的吸收光譜(2)
當光線通過某種物質的溶液時,透過的光的強度減弱.因為有一部分光在溶液的表面反射或分散,一部分光被組成此溶液的物質所吸收,只有一部分光可透過溶液.
入射光 = 反射光 + 分散光 + 吸收光 + 透過光
如果我們用蒸餾水(或組成此溶液的溶劑)作為"空白"去校正反射,分散等因素造成的入射光的損失,則:
入射光 = 吸收光 十 透過光 
2.2.3 物質吸光度(A)與透射比(T)的關系
設 I0 為經過空白校正后入射光的強度;I 為透過光的強度.
根據實驗得知 I = I0 ?10-εc l
式中,c 表示吸收物質的摩爾濃度;l 表示吸收物質的光徑,用cm表示;ε表示吸收物質的摩爾消光系數,它表示物質對光的吸收特性,不同物質的ε數值不同. 所以 I / I0 = 10-εc l 
令 T(透射比) = I / I 0 T = 10-εcl 
若以T對吸收物質的濃度作圖,則得圖1-5-2中的曲線.
由上式可得 1g(1 / T) = εc l 
lg(l / T)為物質的吸光度(A) A = 1g(1 / T) 
2.2.4 Lambert -Beer定律( E = εc l)
上式說明了物質的吸光度與吸收物質的濃度和液層的厚度成正比,這就是光吸收的基本定律--Lambert-Beer(朗伯-比耳)定律.
2.3 分光光度計的基本結構
無論哪一類分光光度計都包括 :光源,單色器,吸收池,檢測器和測量儀表.分光光度計各部件的次序如圖所示: 
5個基本部件
分光光度計的基本部件(1):
光 源: 分光光度計上常用的光源有兩種:鎢絲燈或氫燈,在可見光區,近紫外光區和近紅外光區常用鎢絲燈作為光源;在紫外光區多使用氫弧燈.
單色器:把混合光波分解為單—波長光的裝置.在分光光度計中多用 作為色散元件.
吸收池比色杯,比色皿,比色池)一般由玻璃,石英或熔凝石英制成,用來盛被測的溶液.在低于350 nm的紫外光區工作時,必須采用石英池或熔凝石英池.  
分光光度計的基本部件(2):
吸收池(比色皿)必須與光束方向垂直.此外,每套比色皿的質料,厚度應完全相同,以免產生誤差.比色皿上的指紋,油污或壁上的沉積物都會顯著地影響其透光性,因此在使用前務必徹底清洗.
常用光電池,光電管和光電倍增管三種. 
測量裝置 —般常用的紫外光和可見光分光光度計有3種測量裝置,即電流表,記錄器和數字示值讀數單元.現代的儀器常附有自動記錄器,可自動描出吸收曲線. 
檢測器
棱鏡與光柵
棱 鏡: 光波通過棱鏡時,不同波長的光折射率不同;因而能將不同波長的光分開.玻璃對紫外線的吸收力強,故玻璃棱鏡多用于可見光分光光度計.石英棱鏡可在整個紫外光區傳播光,故在紫外光分光光度計中廣為應用.
衍射光柵: 在石英或玻璃表面上刻劃許多平行線(每英寸約刻15 000—30 000條).由于刻線處不透光,通過光的干涉和衍射使較長的光波偏折角度大,較短的光波偏折角度小,因而形成光譜.
棱鏡單色器裝置示意圖
光源照到棱鏡(或光柵)以前,先要經過一個入射狹縫,再通過平行光鏡使成為平行光束投到棱鏡上.透過棱鏡的光再經另一聚光鏡,在此聚光鏡的焦面內可得一清 楚的光譜圖.如在焦線處放—出射狹縫,轉動棱鏡使光譜移動,就可以從出射狹縫射出所需要的單色光.整個裝置稱為"單色器"
檢測器---光電池
光電池 裝在一個特制的匣子里面由3層物質組成的圓形或長方形薄片.第一層是一種導電性良好的金屬,這是光電池的負極.中間極薄的一層是半導體硒,第3層是鐵,這 是光電池的正極.當光電池受光照射以后,半導體硒的表面逸出電子,這些電子只向負極方向移動,而不向正極移動,因此在上下兩金屬片間產生一個電位差,線路 連通時即產生電流 
檢測器---光電管
光電管 光電管是由封裝在真空透明封套里的一個半圓柱型陰極和一個絲陽極組成.陰極的凹畫上有一層光電發射材料,此種物質經光照射可發射電子.當在兩極間加有電位 時,發射出來的電子就流向絲陽極而產生光電流.對于相同的輻射強度,它所產生的電流約為光電池所產生電流的1/4.由于光電管具有很高的電阻,所以產生的 電流容易放大 .
檢測器---光電倍增管 
光電倍增管 它比普通的光電管優越,它可將第一次發射出的電子數目放大到數百萬倍 .當電子打在兼性陽極上時,能引起更多的電子自表面射出.這些射出的電子又被第二個兼性陽極所吸引,同樣再產生更多的電子.
此過程重復9次后,每個光子可形成106~107個電子.這些電子最后被收集在陽極上.所得到的倍增電流可進一步加以放大和測量. 

 

2.4 分光光度法的測量誤差
分光光度法的測量誤差
選擇適宜波長的入射光
控制吸光度A的遍數范圍
選擇適當的參比溶液
儀器測
量誤差
測量條 
件選擇
2.4.1 儀器測量誤差
由朗伯-比爾定律可知,只有在一定的濃度范圍內,即一定的吸光度范圍同內,由分光光度計測量所引起的測定結果的相對誤差才是較小的;當透光率接近0或 1.0時,其相對誤差趨于無限大;一般在百分透光率在10~80%的范圍內(即吸光度在1~0.1),濃度測量相對誤差較小;對于精密度高的儀器.當吸度 A=0.7-0.2時(百分透光率約為20-60%,測量誤差約為1%.
2.4.2 測量條件選擇
(1)選擇適宜波長的入射光:由于有色物質對光有選擇性吸收,為了使測定結果有較高的靈敏度,必須選擇溶液最大吸收波長的入射光.
(2)控制吸光度A的準確的讀數范圍:由朗伯-比耳定律可知,吸光度只有控制在0.2~0.7讀數范圍內時,測量的準確度較高.
(3)選擇參比溶液:參比溶液是用來調節儀器工作零點的.若樣品溶液,試劑,顯色劑無無色可用蒸餾水作參比溶液;反之應采用不加顯色劑的樣品液作參比溶液.
2.5 顯色反應及其影響因素
顯色反應及其影響因素
顯色反應
一般要求
影響顯色
反應因素
選擇性好
靈敏度高
生成的有色化合物性質穩定
顯色劑與有色物顏色反差大
顯色反應要易于控制
顯色劑用量
反應液的酸堿度(pH)
反應溫度
顯色反應時間
干擾離子的影響
2.5.1 顯色反應一般要求
(1)選擇性好:顯色劑更好只與一種被測組分起顯色反應;
(2)靈敏度高:靈敏度高有笪微量組分的測定;
(3)有色化合物性質穩定:確保前后測定準確.
(4)顯色劑與有色物顏色反差大:兩者最大吸收波長之差應大于60nm;
(5)顯色反應要易于控制:結果的確保實驗再現性.
2.5.2 影響顯色反應的主要因素
(1)顯色劑用量:通過實驗來確定最適用量;
(2)反應液的酸堿度(pH)溶液酸堿度直接影響金屬離子與顯色劑存在形式以及有色化合物組成的穩定性.
(3)反應溫度:不同的顯色反應需要不同的反應溫度,一般顯色反應可在室溫下完成.
(4)顯色反應時間:顯色反應的速度有快有慢.
(5)干擾離子的影響:應采用適當方法消除其影響.
3. 7200型分光光度計的正確使用方法
3.1 結構和工作原理 
3.1.1 儀器結構
3.1.2 工作原理
3.1.3 特點
3.2 使用方法 
3.3 注意事項 
3.1.1 7200型分光光度計儀器結構
7200型光柵分光光度計由光源,單色器,試樣室,光電管,線性運算放大器,對數運算放大器及數字顯示器等部件組成,基本結構如下圖所示.
1.光源;2.單色器;3.試樣室;4.光電管;5.線性運算放大器;6.對數運算放大器;7.數字顯示器
3.1.2 7200型分光光度計工作原理(圖)
7 2 0 0型光柵分光光度計光學系統示意圖 
1.光源燈;2.濾光片;3.球面反射鏡;4.入射狹縫;5.保護玻璃;6.平面反射鏡;7.準直鏡;8.光柵;9.保護玻璃;10.出射狹縫; 11.聚光鏡;12.試樣室; 13.光門;14.光電管; 
3.1.2 7200型分光光度計工作原理(文)
由光源燈(1)發出連續輻射光線,經濾光片(2)和球面反射鏡(3)至單色器的入射狹縫(4)聚焦成像,光束通過入射狹縫(4)經平面反射鏡(6)到準直 鏡(7)產生平行光,射至光柵(8)上色散后又以準直鏡(7)聚焦在出射狹縫(10)上形成一連續光譜,由出射狹縫選擇射出一定波長的單色光,經聚光鏡 (11)聚光后,通過試樣室(12)中的測試溶液部分吸收后,光經光門(13)再照射到光電管(14)上.調整儀器,使透光度為100%,再移動試樣架拉 手,使同一單色光通過測試溶液后照射到光電管上.如果被測樣品有光吸收現象,光量減弱,由光電轉換元件將變化的光信號轉變為電信號,經線性運算放大器和對 數運算放大器處理,將光能的變化程度通過數字顯示器顯示出來.可根據需要直接在數字顯示器上讀取透光度(T),吸光度(A)或濃度(C).
3.1.3 特點
(1) 具有低雜色光,高分辯率的單光束光路結構的單色器;
(2) 具有良好的穩定性,重現性和精確的測量讀數;
(3) 明亮清晰的數字顯示器可顯示透射比,吸光度,濃度和所設置的波長,提高了儀器的讀數準確性;
(4) 采用較新微機處理技術,儀器具有自動設置0%T和100%等控制功能;
(5) 儀器配有標準的RS-232雙向通訊接口,不僅可向計算機發送測試參數,還可接收計算機發出的指令.
(6) 在已知標準溶液濃度前提下,測定未知樣品濃度;
(7)在已知標準溶液濃度斜率前提下,測定未知樣品濃度.

3.2 7200型分光光度計使用方法(基本操作 1)
3.2.1 基本操作 
(1)通電---儀器自檢----預熱20min;
(2)用鍵設置測試方式:透射比(T),吸光度(A),已知標樣濃度方式(C)和已知標樣濃度斜率(K)方式;
(3)波長選擇:用波長調節旋鈕設置所需的單色光波長;
(4)放樣順序:打開樣品室蓋,在1~4號放置比色皿槽中,依次放入%T校具(黑體),參比液,樣品液1和樣品液2.
(5)校具(黑體)校"0.000":將%T校具(黑體)置入光路,在T方式下按"%T"鍵,此時儀器自動校正后顯示"0.000"
(6)參比液校"100"%T或"0.000"A:將參比液拉入光路中,按"0A/100%T"鍵調0A/100%T,此時儀器顯示"BLA",表示儀器正在自動校正,校正完畢后顯示"100"%T或"0.000"A后,表示校正完畢,可以進行樣品測定.
(7)樣品測定:將兩樣品液分別拉入光路中,此時若在"T"方式下則可依次顯示樣品的透射比(透光度)若在"A"方式下,則顯示測得的樣品吸光度.
3.2 7200型分光光度計使用方法(濃度測定)
7200型分光光度儀不僅可以測定未知樣品的透射比(T)和吸光度(A)這兩項基本操作,還可進行未知樣品濃度測定.
(1)在已知標準溶液濃度前提下,測定未知樣品濃度.
(2)在已知標準溶液濃度斜率前提下,測定未知樣品濃度.
備注:以上兩種濃度測定的方法請大家參照實驗教學教材課后自學.
3.3 7200型光柵分光光度計的使用注意事項(1) 
(1) 預熱是保證儀器準確穩定的重要步驟.
(2) 比色皿的清潔程度,直接影響實驗結果.因此,特別要將比色皿清洗干凈.先用自來水將用過的比色皿反復沖洗,然后用蒸餾水淋洗,倒立于濾紙片上,待干后再收回比色皿盒中.必要時,還要對比色皿進行更精細的處理,如用濃硝酸或鉻酸洗液浸泡,沖洗.
(3) 比色皿與分光光度計應配套使用,否則會引起較大的實驗誤差. 比色皿不能單個調換
3.3 7200型光柵分光光度計的使用注意事項(2)
(4) 比色皿內盛液應為其容量的2/3,過少會影響實驗結果,過多易在測量過程中外溢,污染儀器. 比色皿中試樣裝入量應為2/3~3/4之間
(5) 拿放比色皿時,應持其"毛面",杜絕接觸光路通過的"光面".如比色皿外表面有液體,應用綢布拭干,以保證光路通過時不受影響.
(6) 若待測液濃度過大,應選用短光徑的比色皿,一般應使吸光度讀數處于0.1~0.8范圍內為宜.由于測定空白,標準和待測溶液時使用同樣光徑的比色皿,故不必考慮因光徑變化而引起的影響.
4. UV-754型紫外-可見分光光度計正確使用方法
4.1 紫外分光光度法概述
4.2 UV-754型紫外-可見分光光度計結構和工作原理
4.1.1 儀器結構
4.1.2 工作原理
4.3 UV-754型紫外-可見分光光度計使用方法
4.4 UV-754型紫外-可見分光光度計使用注意事項 
4.1 紫外分光光度計法概述(1)
4.1.1 定義 用紫外光源通過分光光度技術對物質進行測定的方法叫作紫外分光光度法.所使用的儀器叫作紫外分光光度計.
4.1.2 原理 因為許多化合物的分子結構中存在共軛雙鍵,在200~400nm的紫外光區具有吸收光的特性,所以無需進行顯色反應便能直接測定. 
4.1.3 應用 常用于對蛋白質和核酸進行定性,定量測定.蛋白質分子中所含酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸殘基在波長280nm處具有最大吸收峰.故常用波長280nm處的吸光度測定蛋白質的濃度.
4.1.4 特點
(1) 組成核酸的堿基也含有共軛雙鍵,其最大吸收峰的波長在260nm處.但在280nm處也有一定的光吸收,對蛋白質的測定有一定的干擾作用.若分別測定280nm和260nm處的吸光度,可通過經驗公式消除核酸對蛋白質測定的影響.
(2)可對微量蛋白質(1~10g/L)不需顯色,進行直接定量測定.因此操作簡便,而且可回收樣品.此外,鹽類在280nm處無光吸收,少量鹽類也不會影響測定結果.
(3)紫外分光光度法完全符合Lambert-Beer定律的基本原理.在其它條件保持一致的情況下,被測溶液的吸光度與被測溶液的濃度成正比. 
4.2 UV-754型分光光度計的結構和工作原理
4.2.1 儀器結構 由光源(鎢燈或氚燈),單色器,試樣室,接受器(光電管),微電流放大器,A/C 轉換器,打印機,鍵盤和顯示器等部件組成.微處理機(CPU)通過輸入,輸出口(I/O)對微電流放大器,顯示器和打印機等部件進行 控制,實現儀器的整體功能.
4.2.2 工作原理(圖)
UV-7 5 4型紫外-可見分光光度計光學系統示意圖 
1.氚燈;2.鎢燈;3.濾光鏡;4.聚光鏡;5.入射狹縫;6.平面;7.準直鏡; 8.光柵; 9.出射狹縫; 10.聚光鏡; 11.試樣室; 12.光門; 13.光電管 
4.2.2 工作原理(文)
由光源氚燈或鎢燈(1或2)發出連續輻射光線經濾光鏡(3)和聚光鏡(4)至單色器入射狹縫(5)處聚焦成像,再經平面反射鏡(6)反射至準直鏡(7)產 生平行光射至光柵(8)在光柵上色散后又經準直鏡(7)聚焦在出射狹縫(9)上成一連續光譜,經出射狹縫射出的光在聚光鏡(10)聚光后分別通過試樣室 (11)中的空白溶液(或對照溶液),標準溶液或樣品溶液,被部分吸收后光經光門(12)再照射到光電管(13)上.被光電管接收的光信號再被轉換成電信 號,后者通過輸入,輸出口(I/O),見上圖.進入微處理機進行調零,變換對數,濃度計算以及打印數據等處理,將檢測結果通過顯示器和打印系統顯示出來.
4.3 UV-754型分光光度計使用方法(外型)
4.3.1 UV-754型紫外可見分光光度計的外觀圖 
1.試樣架拉手;2.鍵盤部分;3.數據打印;4.波長刻度盤; 5.波長手輪;6.電源汗關;7.氚燈觸發按鈕;8.光源室.
4.3 UV-754型分光光度計使用方法(鍵盤)
UV-754型紫外-可見分光光度計的鍵盤示意圖 
鍵盤詳細內容說明如下:
4.3 UV-754型分光光度計使用方法(鍵盤內容1)
① 功能鍵: F1~F8,暫無功能,備擴展使用.
② T鍵: 具有三種透光度狀態調節功能.
③ A/C鍵:吸光度/濃度轉換鍵,按此鍵可分別表示"吸光度0~3A","吸光度0~0.lA","吸光度0~0.1A"和"濃度"四種狀態.
④ 送入鍵:只在"A/C鍵"處于"濃度"狀態時才起作用.
⑤ 打印鍵:手動方式時有效,每按一次,便打印一次數據.
⑥ 控制鍵:在分別使用"設定+","設定一","倍率","顯示方式"和"打印方式"各鍵時,需與控制鍵分別聯合使用才起作用.
⑦ 設定+鍵:在"A/C鍵"處于"濃度"狀態時才能設定"標準濃度值","斜率K值"或"斜率B值"等數據.其功能是將設定數值增加.
4.3 UV-754型分光光度計使用方法(鍵盤內容2)
⑧ 設定- 鍵:是使設定數值減小,操作與"設定+鍵"類同.
⑨ 倍率鍵:用來設定標準溶液濃度的放大倍數.有"1","0.1"和"0.01"三檔,與"控制鍵"同時按下,倍率便發生相應的變化.
⑩ 顯示方式鍵:可表示"積分","濃度"和"樣品號"三種狀態. 
(11) 打印方式鍵:存在"自動"(每移動一次試樣架,儀器自動打印一次數據),"方式1"(手動方式,每按一次此鍵,儀器打印一次數據)和"方式2"(每分鐘定時打印一次數據)三種狀態.每與"控制鍵"同時按一次此鍵便改變一個狀態.
(12) 送紙鍵:每按一次此鍵,儀器移動一次打印紙.
(13) TAC:數字顯示器顯示測定結果或輸入的數據. 
4.3.2 UV-754型紫外可見分光光度計使用方法(1)
(1) 測試準備
① 將盛有"空白"或"對照"溶液的比色皿處于試樣室光路位置;
② 選擇波長 旋動波長手輪選定所需波長;
③ 確定光源 波長在200~290nm時,選擇氚燈為光源;波長在290~360nm時,同時以氚燈和鎢燈為光源;波長在360~850nm時,選擇鎢燈為光源;若使用氚燈,需按氚燈觸發按鈕啟動;
④ 儀器自檢 顯示器顯示"754"后,數字顯示出現"100.0",表明儀器通過自檢程序,此時儀器進入"0~100%","連續"和"自動"狀態(打印系統處于自動打印狀態)
⑤ 儀器預熱30min后方可進行測試. 
4.3.2 UV-754型紫外可見分光光度計使用方法(2)
(2)測試過程
① 數字顯示透光度"100.0"(或吸光度"0.00")2~3s后,將盛有標準溶液的比色皿移至光路,打印系統便自動打印出所得數據; 
② 將盛有樣品溶液的比色皿移至光路,打印系統即自動打印出該樣品的數據.待第一個樣品數據打印完畢后,將第二個樣品置于試樣室光路………,若有多個樣品,操作以此類推.
(3)打印方式
采用"自動"方式打印,依所選定表達方式可打印出以下數據:No(編號) %T(透光度)或ABS(吸光度)或CONC(濃度)
4.4 UV—754型紫外—可見分光光度計注意事項 
(1) 預熱是保證實驗結果準確可靠的必要步驟,不可忽略.
(2) 在波長320nm以下的實驗范圍一定要選用石英比色皿,絕不可以玻璃比色皿替代.
(3) 比色皿需保持清潔,拿放時要符合要求.
(4) 對不同型號和類型的儀器要嚴格按照使用說明操作.
(5) UV-754型紫外-可見分光光度計還可開展"以校正線進行濃度演算"和"用已知斜率K值與B值進行濃度測定"等多種測試方法.
(6)不同蛋白質所含酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸的數量有所差異,此法對不同蛋白質洋品的測定結果有所影響 
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